Nel periodo dei Re di Roma, Tibur entrò a far parte della Lega Latina. La Lega Latina era una alleanza di carattere politico-religioso che riuniva tra loro varie comunità latine presenti nel Lazio.
Verso la fine del VI secolo a.C., la Lega entrò in contrasto con i re Tarquini che governavano Roma e nel 506 a.C. si scontrò anche con i vicini Etruschi. Entrata in aspro conflitto contro Roma, la Lega fu sconfitta in un epico scontro presso il Lago Regillo nell'anno 497 o 496 a. C.. Roma non sottomise gli sconfitti Latini, ma, nel 493 a.C., firmò un trattato di pace che si chiamò Foedus Cassianum. Il trattato federativo, firmato anche da Tibur, sanciva una parità di diritti e di doveri fra Romani e Latini e l'obbligo del reciproco aiuto in caso di aggressioni dall'esterno.
Nel 361 a.C. i Tiburtini ruppero la pace con Roma alleandosi con i Galli, che erano scesi di nuovo in Italia per far guerra a Roma. I Romani inflissero varie sconfitte sia ai Galli che ai Tiburtini, che nel 354 si arresero. Non contenti di essere sottoposti ai Romani, i Tiburtini si unirono di nuovo alle altre città  latine, che cercavano di arginare l'egemonia romana. Nel 338 a.C. con la definitiva vittoria di Roma, la Lega Latina fu sciolta e le città che vi aderivano furono punite. I Tiburtini ebbero una punizione lieve in quanto persero solo parte del territorio, che diventò ager publicus romano. Da questo momento Tibur divenne città romana e la bellezza del suo territorio attirò, specie nell'età imperiale, personaggi ricchi e famosi che vi costruirono le loro ville. Ricordiamo la villa di Augusto, di Mecenate, di orazio, di Quintilio Varo, di Catullo, di Sallustio. Il culmine di tale periodo coincide con la costruzione di Villa Adriana, da parte dell'imperatore Adriano (117-138); la più grande e suntuosa villa, di cui rimangono ampie testimonianze. Nel 273 d.C. Tivoli ospitò l'esilio di Zenobia,
regina del regno di Palmira, sconfitta e fatta prigioniera dall'imperatore Aureliano.
La città prosperò in età  imperiale e vi sorsero numerosi tempi tra cui ricordiamo il tempio di Ercole Vincitore, il tempio della Tosse, il tempio di Vesta, il Tempio alla dea Giunone ed il tempio di Diana. A Tivoli sorse perfino un anfiteatro, detto anfiteatro di Bleso, scoperto nel 1948. L'anfiteatro ospitava i giochi dei gladiatori e le venationes, che erano combattimenti tra uomini e animali feroci. Nel IV° sec. d.C. ebbe inizio il declino di Roma, e Tivoli seguì la stessa sorte. Oltre alle guerre, le  pestilenze  peggiorarono  la  situazione  causando una flessione demografica. Dopo la caduta dell'impero romano si verificò un decadimento urbanistico, causato anche dall’abbandono delle costruzioni.
